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细胞冷冻保存方法中需要用到高速离心机

发布日期:2017-03-24

非玻璃化冻存方法 
下面以肿瘤细胞和杂交瘤细胞为例,介绍非玻璃化冻存细胞的详细过程。

主要材料 
(1)仪器设备:普通冰箱、-300C低温冰箱和-700C~-800C超低温冰箱、液氮冻存罐、高速离心机、电子计算机程控降温仪等;

(2)冻存管:容量为1ml或1.5ml;

(3)冷冻保护液:一般是以9份小牛血清或细胞培养液与1份DMSO混合而成。现配现用,或配制后防入普通冰箱冰盒内冷冻保存。使用前,于室温下水浴溶解;

(4)待冻存细胞:各种肿瘤细胞或杂交瘤细胞。
操作过程 
1. 待冻存细胞悬液的制备

(1) 按常规方法消化处于对数生长期的细胞培养物,制备单细胞悬液,并计算细胞总数

(2) 将细胞悬液以800~1000r/min离心5min,去上清夜;

(3) 向细胞沉淀物中加入冷冻保护液,轻轻吹打混匀,使细胞密度达1×106~1×107个
/ml;

(4) 按每管1~1.5ml的量分装于冻存管内,拧紧管盖;

(5) 再冻存管上做好标记,包括细胞代号及冻存日期。

2. 分级冷冻

(1) 先将冻存管放入普通冰箱冷藏室(4~80C),约40min;

(2) 接着将冻存管置于普通冰箱冷冻室(-100C~-200C),约30~60min;

(3) 将冻存管转入低温冰箱(-300C),放置30min左右;

(4) 然后将冻存管转移到超低温冰箱(-700C~-800C),过夜;

(5) 最后将冻存管投入液氮保存。

3. 记录

做好冻存记录。记录内容包括冻存日期、细胞代号、冻存管数、冻存过程中降温的情况、冻存位置以及操作人员。

 冻存结果 
如此冻存的细胞,其存活率可达90%以上。

讨论 
在使用DMSO前,不要对其进行高压灭菌,因其本身就有灭菌作用。高压灭菌反而会破坏其分子结构,以致降低冷冻保护效果。在常温下,DMSO对人体有毒,故在配制时最好带手套。

在将细胞冻存管投入液氮时,动作要小心、轻巧,以免液氮从液氮罐内溅出。若液氮溅出,可能对皮肤造成冻伤。操作过程中最好带防冻手套、面罩、工作衣或防冻鞋。

应注意控制冻存细胞的质量。既要在冻存前保障细胞具有高活力,还要确保无微生物污染,这样的细胞才具有冻存价值。另外,在每批细胞冻存一段时间后,要复苏1~2管,以观察其活力以及是否受到微生物的污染。

冻存管宜采用塑料冻存管,不宜使用玻璃安瓿。因为在复苏时,需要从-1960C的液氮中取出
冻存管,立即投入37~400C温水中,温差很大,玻璃安瓿瓶容易爆炸而发生危险。