离心机全血基因组提取DNA的应用

离心机全血基因组提取应用

操作步骤（200ul全血）
# 第一次使用前请先在15ml漂洗液WB中加入60ml无水乙醇!

1. 取200ul新鲜、冷冻或加入各种抗凝剂的血液，放入1.5ml离心管。
对如果全血起始量小于200μl，则用缓冲液BB补足到200μl。如果起始量介于200μl-300μl之间，则后续操作需要按照比例增加试剂用量。如果起始量介于300μl-1毫升之间，则需要先进行红细胞裂解操作（见本说明书后附录）。

2. 加入200μl 结合液CB，立刻剧烈颠倒轻摇，充分混匀，再加入20μl蛋白酶K (20mg/ml)溶液，颠倒轻摇充分混匀，70℃放置10分钟，溶液应变清亮（但颜色偏黑色）。

3. 加入100μl 异丙醇，剧烈颠倒轻摇，充分混匀，此时可能会出现絮状沉淀。
上述各操作步骤中适当力度充分混匀非常重要，混匀不充分严重降低产量，必要时如样品粘稠不易混匀时可以涡旋振荡15秒混匀，但不可用手剧烈振荡，以免剪切DNA。

4. 将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱AC中，（吸附柱放入收集管中）10,000 rpm离心30秒，倒掉收集管中的废液。

5. 加入500μl抑制物去除液IR，12,000 rpm 离心30秒，弃废液。

6. 加入700μl漂洗液WB（请先检查是否已加入无水乙醇!），12,000 rpm 离心30秒，弃掉废液。

7. 加入500μl漂洗液WB，12,000 rpm 离心30秒，弃掉废液。

8. 将吸附柱AC放回空收集管中，13,000 rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液, 以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。

9. 取出吸附柱AC，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加100μl洗脱缓冲液EB（洗脱缓冲液事先在 65-70℃水浴中预热）， 室温放置3-5分钟，12,000 rpm 离心1分钟。将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，室温放置2分钟，12,000 rpm离心1分钟。洗脱体积越大，洗脱效率越高，如果需要DNA浓度较高，可以适当减少洗脱体积， 但是最小体积不应少于50μl，体积过小降低DNA洗脱效率，减少DNA产量。

10. DNA可以存放在2-8℃,如果要长时间存放，可以放置在-20℃。

操作步骤（300ul和 1ml全血）

1. 吸取900μl红细胞裂解液（可向本公司购买）到一个1.5ml离心管或者3ml红细胞裂解液到一个15ml离心管。

2．将抗凝全血（使用前回复到室温）颠倒混匀后，吸取300μl全血和1ml全血分别加到上述1.5ml和15ml离心管中，颠倒6-8次，并倒置轻弹管壁，确保充分混匀。

3．室温放置10分钟（期间应该颠倒轻弹混匀数次帮助裂解红细胞）。

4．12,000 rpm离心20秒（对于1.5ml离心管），2,000-3,000 rpm离心5分钟（对于15ml离心管）倒弃红色上清，并小心的尽可能多的吸弃上清（注意不要吸到管底的细胞团），留下完整的管底白细胞团和大约10μl的残留上清。离心后在管底应该见到白色的白细胞团，也可能有一些红细胞残片和白细胞团在一起，但是如果看到的是大部分的红色细胞团，说明红细胞裂解很不充分，应该再加入红细胞裂解液重悬细胞团后重复步骤3，4。
5. 加入200μl缓冲液BB涡旋振荡重悬白细胞团，充分分散白细胞团。其中由于肝素抗凝血的白细胞沉淀团很难打散重悬，影响后续实验裂解效果，建议选用非肝素的抗凝剂收集血液标本。

6. 现在可以按照操作步骤提取DNA了。

操作步骤（10ml全血）

1．吸取30ml红细胞裂解液到一个50ml离心管。

2．将抗凝全血（使用前回复到室温）颠倒混匀后，吸取10ml加到上述装有红细胞裂解液离心管中，颠倒6-8次，并倒置轻弹管壁，确保充分混匀。

3．室温放置10分钟（期间应该颠倒轻弹混匀数次或者摇床上面轻摇帮助裂解红细胞）。

4．2,000 x g离心10分钟，倒弃红色上清，并小心的尽可能多的吸弃上清（注意不要吸到管底的细胞团），留下完整的管底白细胞团和大约100μl的残留上清。离心后在管底应该见到白色的白细胞团，也可能有一些红细胞残片和白细胞团在一起，但是如果看到的是大部分的红色细胞团，说明红细胞裂解很不充分，应该再加入适量红细胞裂解液重悬细胞团后重复步骤3，4。

5. 涡旋振荡15秒重悬白细胞团，充分分散白细胞团。白细胞的重悬分散对下一步裂解非常重要，白细胞未打散就加入裂解液，会导致白细胞不能充分裂解，形成肉眼可见团块。

6． 加入10ml细胞核裂解液到重悬的白细胞，迅速有力吹打几次混匀 以裂解白细胞，由于基因组DNA立刻释放出来，这个时候混合物会马上变得十分粘稠，立刻停止吹打（以免剪切断基因组DNA），颠倒旋转离心管10次保证裂解液和所有的白细胞接触并裂解。这一步对是否获得满意的裂解效果和基因组完整性很关键。吹打力量如果太小，不足以迅速将细胞团打散并和裂解液混匀，形成肉眼可见团块无法裂解完全（裂解液如果是和细胞团块而不是分散的细胞接触，立刻会和细胞团块表面作用后形成粘稠的屏障，不容易再渗透入团块内部）。裂解液和细胞接触后基因组DNA立刻释放出来，这个时候吹打力量过大，又易造成基因组断裂。正确做法，就是迅速有力的吹打几次，几秒钟后基因组释放出来（变粘稠）立刻停止吹打，或者改用大口径枪头（剪去枪头尖）轻柔吹打或者颠倒混匀。如果还有肉眼可见团块，可在65℃温育30-60分钟（不要超过一小时）至裂解完全。

7． 可选步骤：在裂解物中加入RNase A（10mg/ml）至终浓度30μg/ml，颠倒25次混匀，37℃温育15分钟去除残留RNA.然后冷却回室温。

8．加入3.33ml蛋白沉淀液后，在涡旋振荡器上高速连续振荡混匀20-25秒。混匀后可能见到一些小的蛋白团块。由于样品体积重量小，用涡旋振荡器振荡混匀产生的剪切力并不会剪切打断基因组DNA，如果用手振荡混匀，则不可以用手上下剧烈振荡混匀，只能适当力度振荡混匀，否则会剪断基因组DNA，但是力度也不能小,要保证充分混匀，将粘稠的裂解物打散开，否则DNA无法和蛋白质沉淀分离开， 离心的时候会和蛋白质一起沉淀下来，造成DNA丢失或者降低产量。此外混匀不充分也可能造成蛋白沉淀不充分, 最后的产物污染有较多量的蛋白质。因此建议新手还是用涡旋振荡器混匀。

9．2,000 x g(可根据离心效果(沉淀如果不紧)调整加大离心力)离心10分钟。这时候应该可以见到管底暗褐色的蛋白沉淀，也可能见到一些蛋白沉淀漂浮在液体表面。

10．小心吸取上清（大约10ml）到一个新的15ml离心管中。吸取上清时小心不要吸到管底的和漂浮在液体表面的蛋白沉淀，如果不小心将蛋白沉淀转入新的离心管中，可再次离心2分钟后取上清。

11．加入等体积的室温异丙醇（约10ml），轻柔颠倒30次混匀或者直到出现棉絮状（丝状）白色DNA沉淀。
注意有时候棉絮状（丝状）DNA沉淀颠倒混匀的时候，粘附着在盖子或者管口处，即使颠倒也不跟下来，或者附着有气泡导致漂浮在液面，这样导致操作者看不到沉淀，误认为没有得到DNA。解决办法是略去步骤12，直接2，000 x g离心1分钟，弃上清，然后接步骤14。

12．垂直放置离心管，让白色DNA沉淀自然沉到管底，然后尽可能多的吸弃大部分的上清，注意不要吸到沉淀。

13．加入10ml70％乙醇后，颠倒混匀，2,000 x g离心1-3分钟，在管底可以见到白色的DNA沉淀块，倒弃上清。

14．加入3ml70％乙醇，颠倒几次漂洗DNA沉淀，2,000 x g离心1分钟, 倒去上清（沉淀很松，注意不要把DNA沉淀倒掉了），倒置后在吸水纸上轻敲几下以控干残留乙醇，还可以用枪头小心吸掉管底沉淀周围和管壁的残留乙醇，空气晾干沉淀几分钟。注意不要干燥过头，否则DNA极其难溶，也不能残留太多乙醇，否则乙醇可能抑制下游如酶切反应。

15．加入600μlDNA（或者根据浓度需要调整用量）溶解液重新水化溶解DNA沉淀，轻弹管壁混匀，可以放置在65℃温育30-60分钟（不要超过一小时），也可以在室温或者4℃放置过夜来重新水化DNA，中间不时的轻弹管壁帮助重新水化DNA。

16. DNA可以存放在2-8℃,如果要长时间存放，可以放置在-20℃。