非玻璃化冻存方法 
下面以肿瘤细胞和杂交瘤细胞为例，介绍非玻璃化冻存细胞的详细过程。

主要材料 
（1）仪器设备：普通冰箱、-300C低温冰箱和-700C～-800C超低温冰箱、液氮冻存罐、高速离心机、电子计算机程控降温仪等；

（2）冻存管：容量为1ml或1.5ml；

（3）冷冻保护液：一般是以9份小牛血清或细胞培养液与1份DMSO混合而成。现配现用，或配制后防入普通冰箱冰盒内冷冻保存。使用前，于室温下水浴溶解；

（4）待冻存细胞：各种肿瘤细胞或杂交瘤细胞。
操作过程 
1. 待冻存细胞悬液的制备

(1) 按常规方法消化处于对数生长期的细胞培养物，制备单细胞悬液，并计算细胞总数
；

(2) 将细胞悬液以800～1000r/min离心5min，去上清夜；

(3) 向细胞沉淀物中加入冷冻保护液，轻轻吹打混匀，使细胞密度达1×106～1×107个
/ml；

(4) 按每管1～1.5ml的量分装于冻存管内，拧紧管盖；

(5) 再冻存管上做好标记，包括细胞代号及冻存日期。

2. 分级冷冻

(1) 先将冻存管放入普通冰箱冷藏室（4～80C），约40min；

(2) 接着将冻存管置于普通冰箱冷冻室（-100C～-200C），约30～60min；

(3) 将冻存管转入低温冰箱（-300C），放置30min左右；

(4) 然后将冻存管转移到超低温冰箱（-700C～-800C），过夜；

(5) 最后将冻存管投入液氮保存。

3. 记录

做好冻存记录。记录内容包括冻存日期、细胞代号、冻存管数、冻存过程中降温的情况、冻存位置以及操作人员。

 冻存结果 
如此冻存的细胞，其存活率可达90%以上。

讨论 
在使用DMSO前，不要对其进行高压灭菌，因其本身就有灭菌作用。高压灭菌反而会破坏其分子结构，以致降低冷冻保护效果。在常温下，DMSO对人体有毒，故在配制时最好带手套。

在将细胞冻存管投入液氮时，动作要小心、轻巧，以免液氮从液氮罐内溅出。若液氮溅出，可能对皮肤造成冻伤。操作过程中最好带防冻手套、面罩、工作衣或防冻鞋。

应注意控制冻存细胞的质量。既要在冻存前保障细胞具有高活力，还要确保无微生物污染，这样的细胞才具有冻存价值。另外，在每批细胞冻存一段时间后，要复苏1～2管，以观察其活力以及是否受到微生物的污染。

冻存管宜采用塑料冻存管，不宜使用玻璃安瓿。因为在复苏时，需要从-1960C的液氮中取出
冻存管，立即投入37～400C温水中，温差很大，玻璃安瓿瓶容易爆炸而发生危险。