台式低速离心机分离叶肉细胞的方法

一、离心机分离法

分离叶肉细胞 [仪器与用具] 组织捣碎机一台(或研钵一套); 低速台式离心机1台; 100目尼龙纱布30cm×30cm 1块; 100ml量筒1个; 100ml烧杯2个; 200ml烧杯1个; 冰瓶1个; 离心管、吸管若干。

[试 剂] STN液(蔗糖0.4mol·L-1，Tricine 20mmol·L-1 pH 7.8， NaCl 10mmol·L-1)。将137g 蔗糖、3.58g Tricine(三羟甲基甘氨酸)、0.58g NaCl溶于800ml左右水中，用NaOH溶液调至pH 7.8，加水至1000ml。STN液置0-4℃冰箱中备用。

[方 法]
 1．选用山芋、大豆等植物的嫩叶50g左右，洗净，去叶脉，剪成2mm左右宽的叶条，放入捣碎机中，加入150ml左右的冷STN液，以10000转/分，快速捣碎15秒，或将10g左右叶片剪碎，放入研钵中，加入50ml冷STN液，研磨1分钟。

 2．先将匀浆用100目的单层尼龙纱布过滤，将滤液用台式离心机低速(500转/min)离心30秒。去上层液，用少量STN液悬浮沉淀，悬浮液即为叶肉细胞。如果第一次离心后，沉淀中细胞碎片较多,可再悬浮离心一次。提取过程最好在4℃左右温度下进行。

 3. 细胞悬浮液放冰瓶中备用。

 二、酶解法

分离叶肉细胞 [仪器与用具] 抽真空装置1套或大针筒1套; 恒温水浴(最好用恒温振荡器)1台; 感量0.01g天平1台; 离心机1台; 100和50ml烧杯各2个; 镊子1把; 剪刀1把; 100目尼龙纱布30cm×30cm 1块; 刀片一把; 载玻片一块。

 [试 剂] 分离介质：糖醇0.4mol·L-1 (称7.3g山梨醇或甘露醇定溶于100ml水中)，，离析酶(Macerozyme R-10)3％，葡聚糖硫酸钾0.4％与聚乙烯吡咯烷酮2％，pH5.6~5.8，称0.3g离析酶、0.04g葡聚糖硫酸钾、0.2g聚乙烯吡咯烷酮溶于10ml 0.4mol·L-1山梨甘露醇溶液中，滴加HCl调至pH 5.6~5.8。 悬浮介质：STN液（配法同上）。

 [方 法]
 1． 取蚕豆等嫩叶2g左右，用镊子撕去下表皮。不能撕表皮的可用剪刀剪，或用刀片切成2mm宽碎条。放烧杯中，加20ml分离介质，用抽真空装置或针筒真空渗入15秒，使分离介质渗入叶内。

 2． 将酶解体系放入25~30℃水浴中，每隔2-3分钟振动一次，酶解30分钟左右,直至肉眼可见溶液中有较多的叶肉细胞沉淀为止。

 3． 用100目尼龙纱布过滤酶解介质，将滤液500转/min离心30秒，舍去上层液，用10ml STN液悬浮沉淀，再离心一次，去上层液，沉淀中加入2mlSTN液稀释，即得到叶肉细胞悬浮液，细胞悬浮液置冰瓶中备用。

 三、细胞活力的检查

 [仪器与用具] 显微镜1台；氧电极测定光合放氧装置(见实验23)1套；吸管3支；5mL、1mL移液管各2支；0.1mL微量进样器；载玻片与盖玻片若干等。

 [试 剂] 0.1％酚藏红花染液； 光合放氧测定介质(Tricine 50mmol L-1 pH7.6，NaHCO3 20mmol L-1，蔗糖0.4mol L-1) 称0.9gTricine、10.3g蔗糖、0.17gNaHCO3溶于80mL水中，用稀NaOH调至pH7.6，加水至100mL。

 [方 法]
 1、 检细胞形态： 叶片中叶肉细胞的大部分是栅栏细胞和海绵细胞，多数呈花生形。活的叶肉细胞中的叶绿体排列规则，分布均匀，在高倍镜下能看到细胞器在原生质体中移动。而受伤和死细胞，细胞收缩，叶绿体排列混乱，甚至解体，细胞内颗粒作无规则的布朗运动。

 2、 色检查： 将0.1％酚藏红花染液同细胞悬浮液混合，几分钟后镜检。死细胞被染上红色，而活细胞不被染色。

 3、合放氧活性测定： 在氧电极反应杯中加5份光合放氧测定介质，1份细胞悬浮液，照光，观察是否有放氧反应。

 注意事项

 1. 不是所有植物的叶片都能用机械法分离出完整的叶肉细胞的，机械法仅适用于山芋、大豆、花生、苹果、槐树等植物叶片。分离细胞的活性还与叶龄有关，如分离具有高活性的大豆叶肉细胞,应采集倒2、倒3的嫩叶作为材料。

 2. 离体的叶肉细胞的活性随离体时间延长而降低。