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离心机知识

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利用台式高速冷冻离心机提取植物蛋白

发布时间： 2016-10-24

一、植物组织蛋白质提取方法
　　
　　1、根据样品重量(1g样品加入3.5ml提取液，可根据材料不同适当加入)，准备提取液放在冰上。
　　
　　2、把样品放在研钵中用液氮研磨，研磨后加入提取液中在冰上静置(3-4小时)。
　　
　　3、用高速台式冷冻离心机离心8000rpm40min4℃或11100rpm20min4℃
　　
　　4、提取上清液，样品制备完成。
　　
　　蛋白质提取液：300ml
　　
　　1、1Mtris-HCl(PH8)45ml
　　
　　2、甘油(Glycerol)75ml
　　
　　3、聚乙烯吡咯烷酮(Polyvinylpolypyrrordone)6g
　　
　　这种方法针对SDS-PAGE，垂直板电泳！
　　
二、植物组织蛋白质提取方法
　　
　　氯醋酸—丙酮沉淀法
　　
　　1、在液氮中研磨叶片
　　
　　2、加入样品体积3倍的提取液在-20℃的条件下过夜，然后高速台式冷冻离心机离心(4℃8000rpm以上1小时)弃上清。
　　
　　3、加入等体积的冰浴丙酮(含0.07%的β-巯基乙醇)，摇匀后高速台式冷冻离心机离心(4℃8000rpm以上1小时)，然后真空干燥沉淀，备用。
　　
　　4、上样前加入裂解液，室温放置30分钟，使蛋白充分溶于裂解液中，然后离心(15℃8000rpm以上1小时或更长时间以没有沉淀为标准)，可临时保存在4℃待用。
　　
　　5、用Brandford法定量蛋白，然后可分装放入-80℃备用。
　　
　　药品：提取液：含10%TCA和0.07%的β-巯基乙醇的丙酮。裂解液：2.7g尿素0.2gCHAPS溶于3ml灭菌的去离子水中(终体积为5ml)，使用前再加入1M的DTT65ul/ml。
　　
　　这种方法针对双向电泳，杂质少，离子浓度小的特点！当然单向电泳也同样适用，只是电泳的条带会减少！
　　
三、组织：肠黏膜
　　
　　目的：WESTERNBLOT检测凋亡相关蛋白的表达
　　
　　应用TRIPURE提取蛋白质步骤：
　　
　　含蛋白质上清液中加入异丙醇：(1.5ml每1mlTRIPURE用量)
　　
　　倒转混匀，置室温10min
　　
　　高速冷冻离心机离心：12000g，10min，4度，弃上清
　　
　　加入0.3M盐酸胍/95％乙醇：(2ml每1mlTRIPURE用量)
　　
　　振荡，置室温20min
　　
　　高速冷冻离心机离心：7500g，5min，4度，弃上清
　　
　　重复0.3M盐酸胍/95％乙醇步2次
　　
　　沉淀中加入100％乙醇2ml
　　
　　充分振荡混匀，置室温20min
　　
　　高速冷冻离心机离心：7500g，5min，4度，弃上清吹干沉淀
　　
　　1％SDS溶解沉淀
　　
　　高速冷冻离心机离心：10000g，10min，4度
　　
　　取上清-20度保存(或可直接用于WESTERNBLOT)
　　
　　存在的问题：加入1％SDS后沉淀不溶解，还是很大的一块，4度离心后又多了白色沉定，SDS结晶？测浓度，含量才1mg/ml左右。
　　
　　解决：提蛋白试剂盒，另外组织大小适中，要碎，立即加2XBUFFER，然后煮5－10分钟，效果很好的。
　　
　　四、植物材料：水稻苗，叶鞘，根
　　
　　1、200毫克样品置于冰上磨碎
　　
　　2、加lysisbuffer，离心，10000rpm，4度，5min取上清
　　
　　3、重复离心5min
　　
　　lysisbuffer：ureanp-40ampholine2-mepvp-40
　　
五、蛋白质样品制备
　　
　　秧苗蛋白质样品的提取按Davermal等(1986)的方法进行。
　　
　　100mg材料剪碎后加入10mgPVP-40(聚乙烯吡咯烷酮)及少量石英砂，用液氮研磨成粉，加入1.5ml10%三氯乙酸(丙酮配制，含10mM即0.07%β-巯基乙醇)，混匀，-20℃沉淀1小时，台式高速冷冻离心机4℃，15000r/min离心15min，弃上清，沉淀复溶于1.5ml冷丙酮(含10mMβ-巯基乙醇)，再于-20℃沉淀1小时，同上离心弃上清，(有必要再用80％丙酮(含10mMβ-巯基乙醇所得沉淀低温冷冻真空抽干。
　　
　　按每mg干粉加入20μl(可调)UKS液[9.5M尿素，5mM碳酸钾，1.25%SDS，0.5%DTT(二硫苏糖醇)，2%Ampholine(AmershamPharmaciaBiotechInc，pH3.5-10)，6%TritonX-100]，37℃温育30min，期间搅动几次，28度(温度低，高浓度的尿素会让溶液结冰)台式高速冷冻离心机16000r/min离心15min，离心力越大时间长一点越好！上清即可上样电泳。或者-70度保存
　　
六、植物根中蛋白质的抽取
　　
　　(1)sample,液氮研磨
　　
　　(2)装1.5mlcentrifuge用tube
　　
　　(3)加1MKH2PO4K2HPO4700ul
　　
　　(4)12000rpm,4度,10-15minite
　　
　　(5)取上层液，蛋白质就在里面

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